Сегодня давайте поговорим о проблеме, которая вызвала бесчисленное количество головных болей коллег -исследователей - эксперимент с вестерн -блоттингом (WB). Этот, казалось бы, простой, но полный эксперимента «ловушек», почему он всегда заставляет нас спотыкать снова и снова? Теперь давайте рассмотрим причины неудач вместе.
I. Нет групп
Возможные причины могут включать:
- Проблемы с антителами: антитело может быть неэффективным, неспецифическим или не связывающимся с целевым белком.
- Проблемы выборки: выборка может содержать мешающие вещества, быть слишком низкими в концентрации или уже ухудшается.
- Проблемы с электрофорезом: неуместные условия электрофореза, такие как напряжение, время или ненадлежащее использование буфера.
- Проблемы с передачей: проблемы во время процесса переноса, такие как неуместный выбор мембраны, время переноса или буфер переноса.
- Проблемы с блокировкой: блокирующее решение может быть неуместным или время блокировки может быть слишком длинным.
- Проблемы окрашивания: окрашивающий реагент может быть истек, нечувствителен или неправильно используется.
Проблемы с оборудованием: оборудование может неисправно или не быть должным образом откалибровано.
- Экспериментальные вопросы операции: экспериментальная операция не может быть стандартизирована, например, недостаточная промывка или неровная нагрузка образца.
- Проблемы модификации белка: целевой белок может подвергаться посттрансляционным модификациям, которые предотвращают распознавание антител.
- Проблемы экспрессии целевого белка: целевой белок может иметь очень низкую экспрессию или отсутствие экспрессии в клетках или тканях, которые обнаруживаются.
II Высокий фон
Возможные причины могут включать:
- Высокая концентрация антител. Использование слишком большого количества антител может увеличить неспецифическое связывание, что приводит к высоким фоном.
- Проблемы с качеством антител: антитело может иметь высокое неспецифическое связывание или перекрестное реакцию с другими белками.
- Недостаточно блокировки: блокирующий раствор не может эффективно охватывать неспецифические сайты связывания на мембране, что приводит к высоким фонам.
- Мембранные проблемы: мембрана может иметь низкое качество или загрязнение, что приводит к высокой области.
- Неполный перенос: во время процесса переноса белки не могут быть полностью перенесены на мембрану, что приводит к высокой основе.
- Недостаточная промывка: этапы промывки не могут эффективно удалять несвязанные антитела или другие примеси, что приводит к высоким фонам.
- Проблемы с реагентом окрашивания: реагент окрашивания может быть слишком чувствительным или нестабильным, что приводит к высоким фонам.
- Экспериментальные проблемы с оборудованием: оборудование может иметь утечку или вмешательство, что приводит к высокой основе.
- Проблемы образца белка: образец может содержать большое количество мешающих веществ, таких как продукты разложения белка или другие примеси.
- Экспериментальные вопросы операции: экспериментальная операция не может быть стандартизирована, например, длительное время инкубации или высокая температура.
Iii. Неспецифические полосы или неверные размеры белковых полос
Возможные причины могут включать:
- Слишком много пассажей клеток, приводящих к различным уровням экспрессии белка, что приводит к непоследовательным размерам полос или наличию нескольких полос.
- Деградация образца белка, что приводит к более низкой молекулярной массе белка или наличию нескольких полос.
- Образцы белка, экспрессируемые in vivo, могут иметь различные формы модификаций, такие как ацетилирование, метилирование, алкилирование, фосфорилирование и гликозилирование, что приводит к непоследовательным размерам полос или наличию нескольких полос.
- Целевой белок содержит несколько вариантов изоформ или сплайсинга, что приводит к непоследовательным размерам полос или наличию нескольких полос.
